Сведения об авторах
Солодкий Владимир Алексеевич – академик РАН, профессор, директор ФГБУ
«Российский научный центр Рентгенорадиологии» Минздрава России, SPIN-код: 9556- 6556, Author ID: 440543.
Павлов Андрей Юрьевич – д.м.н., профессор, заместитель директора по научно лечебной работе ФГБУ “Российский научный центр Рентгенорадиологии” МЗ РФ;
https://orcid.org/0000-0002-2905-7735
E-mail: pavlovdetur@mail.ru
Дзидзария Александр Гудисович – к.м.н., заведующий онкоурологическим отделением ФГБУ “Российский научный центр Рентгенорадиологии” МЗ РФ;
https://orcid.org/0000-0001-5789-375X
E-mail: dzidzariamd@gmail.com
Боженко Владимир Константинович – д.м.н., профессор, заведующий отделом молекулярной биологии и экспериментальной терапии опухолей
Гафанов Рустем Айратович, к.м.н., старший научный сотрудник отделения онкоурологии ФГБУ «РНЦРР» МЗ РФ
Контактное лицо: Гафанов Рустем Айратович
Адрес: 117485, Россия, Москва, ул. Профсоюзная, д. 86
E-mail: docgra@mail.ru
https://orcid.org/0000-0002-7592-0392 SPIN-код: 2663-3760, AuthorID: 96769 +7-916-659-02-24
Мирзаханов Рамиль Ирекович – врач-уролог, аспирант ФГБУ “Российский научный центр Рентгенорадиологии” МЗ РФ; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9739-4744
Узденов Расул Анзорович – врач-уролог отделения онкоурологии ФГБУ “Российский научный центр Рентгенорадиологии” МЗ РФ;
Рак мочевого пузыря представляет собой гетерогенное заболевание с различными молекулярными характеристиками. Причиной расхождения ожидаемого прогноза, основанного на клинико-морфологических параметрах опухоли и фактического исхода, является молекулярно-генетическая детерминация прогрессии и рецидива мышечно- неинвазивной опухоли мочевого пузыря.
Экспрессия генов MYBL и TLR2 играют важную роль в онкогенезе, соответственно современные подходы в лечении, основанные на анализе результатов экспрессии генов онкогенеза, могут помочь в создании персонифицированного алгоритма диагностики и лечения.
Ключевые слова: MYBL, TLR2, молекулярно-генетика, уротелиальный рак, мышечно- неинвазивный рак.
The role mRNA MYBL, TLR2 expression in the recurrence of non-invasive muscle bladder cancer
Pavlov A.Y., Dzidzaria A.G., Bozhenko V.K., Gafanov R.A. Mirzakhanov R.I., Uzdenov R.A., Solodkiy V.A.
Federal State Budgetary Institution Russian Scientific Center of Roentgenoradiology (RSCRR) of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation Russian Scientific Center of Roentgenoradiology, 117997 Moscow, Profsoyu znaya str., 86
Введение
Рак мочевого пузыря представляет собой гетерогенное заболевание с различными молекулярными характеристиками [1]. MYBL2 – это физиологический регулятор клеточного цикла, который экспрессируется в пролиферирующих клетках, особенно в эмбриональных стволовых и гемопоэтических клетках-предшественниках [2, 3, 4]. Экспрессия MYBL2 практически не обнаруживается в фазе G0 и индуцируется при переходе клеточного цикла G1/S [5, 6]. Принимая во внимание вышесказанное, данные указывают на то, что MYBL2 участвует в пролиферации клеток и канцерогенезе.
На сегодняшний день MYBL2 часто обнаруживается у пациентов с раком молочной железы, колоректальным раком, раком мочевого пузыря, гепатоцеллюлярной карциномой, нейробластомой и острым миелоидным лейкозом [7, 8, 9, 10, 11, 12]. Несмотря на установленную связь между экспрессией MYBL2 и клинико-патологическими особенностями вышеуказанных опухолей, большинство существующих исследований ограничены размером выборки, морфофункциональными характеристиками ткани. Кроме того, остаётся открытым вопрос: какими являются показания к исследованию мРНК MYBL2, как биомаркера? В данной работе мы исследовали влияние повышенной экспрессии мРНК гена MYBL2 на агрессивность течения и риски рецидивирования мышечно-неинвазивного рака мочевого пузыря.
Но не только MYBL2 привлекает внимание исследователей. В нескольких работах изучались различные молекулярные аспекты РМП, что привело к идентификации молекулярных биомаркеров, участвующих в развитии РМП. [13, 14]
В настоящее время агонисты Toll-подобных рецепторов (TLR) считаются эффективными иммуностимуляторами с иммунотерапевтическим потенциалом против нескольких видов рака, включая рак мочевого пузыря. Бацилла Кальметта-Герена ([БЦЖ], агонист TLR2 и TLR4) одобрена Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) для внутрипузырного лечения РМП.
Несколько исследований показали роль TLR как в ингибировании, так и в прогрессировании опухоли и метастазов [15]. Было высказано предположение, что сигнальные пути TLR приводят к привлечению большего количества иммунных клеток для повышения иммунитета в микроокружении опухоли. Эти опухолевые клетки выделяют дополнительные ангиогенные и ростовые факторы, которые повышают устойчивость опухолевых клеток к атаке цитотоксических Т-лимфоцитов [16]. Следовательно, опухолевые клетки ускользают от иммунной системы хозяина [17].
Несмотря на неоднозначный вклад TLR в иммунный ответ мочевого пузыря на раковые клетки, необходимы дальнейшие исследования для утверждения стратегий диагностики и лечения с использованием TLR.
Существуют многочисленные исследования молекулярных и иммунологических маркеров РМП, однако точные механизмы, участвующие в рецидивировании и прогрессировании еще предстоит выяснить. Мы исследовали значение сочетания экспрессии этих факторов в ткани опухоли РМП для оценки прогноза рецидивирования мышечно неинвазивного рака.
Материалы и методы исследования.
В исследование вошли пациенты получавшие специализированное лечение на базе ФГБУ РНЦРР с 2017 по 2020 год. Было выделено три группы больных: 1 группу составили первичные пациенты с МНИРМП (n=83), во 2 группу вошли пациенты после специализированного хирургического лечения МНИРМП (n=81) в виде ТУР мочевого пузыря с опухолями и в 3 группу были распределены пациенты без МНИРМП с другими онкологическими и неонкологическими диагнозами (ДГПЖ, МКБ, рак простаты) (n=70).
Методом ПЦР была определена экспрессия мРНК следующих генов: MYBL2 и TLR2, которые отвечают за адгезию, апоптоз, пролиферацию, регуляцию иммунитета, ремоделирование межклеточного матрикса. Биоптаты были получены при цистоскопии в момент хирургического лечения, динамического наблюдения и плановых осмотров (1 раз в 3 месяца в течение первого года наблюдений, далее 1 раз в полгода – 2 года). По нашим данным в опухолевой ткани МНИРМП получена достоверная гиперэкспрессия ряда генов, в числе которых определялись MYBL и TLR2 (p <0,02).
Уровень экспрессии мРНК измеряли с помощью наборов, производства ООО «ДНК Технология» Россия. Нормализацию проводили по методике Vandesompele et al. с использованием 3 контрольных генов HKG (House Keeping Gene), как описано в отечественной статье. [18]. Среди контрольных генов использовали бета-2-микроглобулин (B2M), бета-глюкуронидазу (GUSB) и гипоксантин-гуанин фосфорибосилтрансферазу 1 (HPRT1).
Статистические методы исследования.
Для признаков с распределением, значимо отличающимся от нормального, рассчитывалась медиана, квартили и применялись непараметрические методы сравнения несвязанных признаков (критерий Краскелла-Уоллиса при количестве сравниваемых групп более двух и критерий Манна-Уитни при сопоставлении двух групп). Для связанных параметров применялся критерий Уилкоксона.
При сравнении частот строились таблицы сопряженности признаков. Для расчета р использовался критерий Фишера (при небольших объемах групп) и непараметрический критерий χt-2. Для частот, характеризующих чувствительность и специфичность, рассчитывали 95% доверительные интервалы. Различия считали статистически значимыми при р <0,05.
Проводился корреляционный анализ Пирсона (и коэффициент Спирмена для непараметрических данных) с расчетом коэффициента корреляции и уровня его значимости.
Пороговые значения изучаемых показателей, разделяющие исследуемые группы, определялся методом построения кривых ROC.
Расчет безрецидивной выживаемости выполнялся методом Каплана-Мейера, сравнение кривых выживаемости выполнялся методом Cox и Log-Rank.
Все вычисления проводились на персональном компьютере с помощью математических пакетов «STATISTICA-12» и SPSS-22.
Результаты исследования
Характеристики пациентов, вошедших в исследование представлены в таблице 1,2,3 Таблица 1. Распределение пациентов по возрастам в группах.
|
Группы |
Средний возраст (лет) |
Кол-во больных |
Возраст мин |
Возраст макс |
|
1 |
66,3 |
83 |
29,0 |
91,0 |
|
2 |
60,8* |
81 |
22,0 |
91,0 |
|
3 |
58,4** |
70 |
20,0 |
89,0 |
|
Всего |
62,0 |
234 |
20,0 |
91,0 |
*- р=0,03; ** - р=0,002
Таблица 2. Распределение пациентов в зависимости от степени дифференцировки опухоли.
|
Группы |
Степень дифференцировки |
Всего |
||
|
G1 |
G2 |
G3 |
||
|
1 |
47 (56,6%) |
2 (2,4%) |
34 (41%) |
83 |
|
2 |
38 (46,9%) |
3 (3,7%) |
40 (49,3%) |
81 |
|
Всего |
85 |
5 |
74 |
166 |
(р>0,05).
Таблица 3. Анализ факторов прогноза течения заболевания.
|
Группа |
Количество очагов |
Всего |
|||
|
1 |
2-7 |
≥8 |
|||
|
1 |
71 ((85,5%) |
11 (13,3%) |
1 (1,2%) |
83 |
|
|
2 |
49 (60,5%) |
19 (23,5%) |
13 (16%) |
81 |
|
|
Всего |
120 |
30 |
14 |
164 |
|
|
Группа |
Размер первичной опухоли |
Всего |
|||
|
< 3см |
≥ 3см |
||||
|
1 |
58 (69,9%) |
25 (30,1%) |
83 |
||
|
2 |
44 (54,4%) |
37 (45,6%) |
81 |
||
|
Всего |
102 |
62 |
164 |
||
Данные характеристик MYBL2 по группам
В 1 группе медиана MYBL2 составила 227,6, во 2 и 3 группах по 12,6. (p <0,0001),
среднее значение составило 502,9, 68,5, 41,2. (p <0,0001). Таблица 4 Таблица 4. Характеристика экспрессии MYBL в группах исследования.
|
Группы |
Среднее значение |
Кол-во пациентов |
Мин. значение |
Макс. значение |
Q25 |
Медиана |
Q75 |
Перцентиль |
|
|
5,00 |
95,00 |
||||||||
|
1 |
502,9* |
83 |
0 |
10085,5 |
60,8 |
227,6* |
521,0 |
0 |
172,2 |
|
2 |
68,5 |
81 |
0 |
1552,1 |
3,6 |
12,6 |
52,0 |
0 |
294,1 |
|
3 |
41,2 |
70 |
0 |
315,2 |
0 |
12,6 |
39,4 |
0 |
274,4 |
|
Всего |
|
234 |
|
|
|
|
|
|
|
(p <0,02).
Данные по экспрессии мРНК TLR2 в образцах тканей представлены в таблице 5, среднее значение составило в 1 группе 73,8 о.е., максимальное значение 2998,4 (p <0,02).
Таблица 5. Характеристика экспрессии мРНК TLR2 в исследуемых группах.
|
Группы |
Среднее значение |
Кол-во пациентов |
Мин. значение |
Макс. значение |
Q25 |
Медиана |
Q75 |
Перцентиль |
|
|
5,00 |
95,00 |
||||||||
|
|
TLR2 |
||||||||
|
1 |
73,8 |
83 |
0 |
2998,4 |
0 |
13,7 |
66,3 |
0 |
187,4 |
|
2 |
29,2 |
81 |
0 |
230,7 |
0 |
0* |
48,5 |
0 |
137,2 |
|
3 |
74,0 |
70 |
0 |
922,9 |
0 |
39,4* |
81,6 |
0 |
326,3 |
|
Всего |
|
234 |
|
|
|
*- Р=0,003 |
|
|
|
(p<0,02).
Анализ безрецидивной выживаемости
На рисунке 1 представлен проведённый нами анализ безрецидивной выживаемости (БРВ) пациентов в группах, по данным которого медиана БРВ составила 23,7 месяца.
Рисунок 1. Анализ безрецидивной выживаемости в исследуемых группах.
Вторым этапом нами была выполнена оценка безрецидивной выживаемости в зависимости от уровня экспрессии генов. На рисунке 2 построен график БРВ во взаимосвязи с уровнем экспрессии MYBL2. Достоверно определяется корреляция: MYBL2 £ 80 о.е. медиана 42,2 мес., 1-летняя БРВ – 88 ± 9,1%; MYBL2 > 80 о.е. медиана 14 месяцев, 1-летняя БРВ – 57 ± 9,1%, 2-хлетняя – 38 ± 10,2% (р=0,01).
Рисунок 2. Безрецидивная выживаемость в зависимости от MYBL2.
Проведенный нами анализ результатов экспрессии мРНК TRL2 с безрецидивной выживаемости не выявил достоверной корреляции, однако дальнейший анализ, определил корреляцию сочетания генов MYBL2 + TLR выше пороговых значений.
Таблица 6. Безрецидивная выживаемость в месяцах с учетом мРНК генов MYBL2 и TLR.
|
Сочетания генов |
Медиана |
Безрецидивная выживаемость |
р |
||
|
1 - летняя |
2-хлетняя |
3- хлетняя |
|||
|
MYBL2≤80+TRL2≤70 |
Не достигнута |
90,9±8,7 |
90,9±8,7 |
90,9±8,7 |
0,051 |
|
MYBL2>80+TRL2>70 |
11,8 месяцев |
37,5±17,1 |
12,5±12,0 |
0 |
|
Из таблицы 6 видно, что благоприятный прогноз по данным безрецидивной выживаемости ожидается у пациентов с экспрессией MYBL2£ 80 + TLR2£ 70 о.е., 1-летняя, 2-хлетняя и 3-хлетняя БРВ 90,9 ± 8,7%, медиана БРВ еще не достигнута (р=0,051).
Неблагоприятный прогноз по данным безрецидивной выживаемости ожидаем у пациентов при сочетании гиперэкспрессии MYBL2 >80 + TLR2> 70. В случае сочетания 1- летняя БРВ – 37,5 ± 17,1%, 2-хлетня – 12,5 ± 12,0%, 3-хлетняя – 0 (р=0,051), медиана – 11,8 месяцев. Рисунок 3
Рисунок 3. Безрецидивная выживаемость при сочетании экспрессии мРНК генов MYBL2+TLR2.
Выводы
На основании выполненного анализа экспрессии в опухолевой ткани МНИРМП, получено достоверное повышение MYBL2 и TLR2. Обнаружена достоверная корреляция безрецидивной выживаемости пациентов с МНИРМП с гиперэкспрессией в тканях опухоли MYBL2 и сочетанием MYBL2 + TLR2. По данным нашей работы данные варианты экспрессии генов можно отнести к маркерам высокого риска рецидива заболевания.
Список литературы
1. Knowles MA, Hurst CD. Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity. Nat Rev Cancer. 2015;15(1):25-41
2. A. Sala, R. Watson, B-Myb protein in cellular proliferation, transcription control, and cancer: Latest developments, J. Cell. Physiol., 3 (1999), 245−250. doi: 10.1002/(SICI)1097- 4652(199906)179:3<245:AID-JCP1>3.0.CO;2-H.
3. M. Bessa, M. Joaquin, F. Tavner, M. K. Saville, R. J. Watson, Regulation of the cell cycle by B-Myb, Blood Cells Mol. Dis., 2 (2001), 416−421. doi: 10.1006/bcmd.2001.0399
4. K. V. Tarasov, Y. S. Tarasova, W. L. Tam, D. R. Riordon, S. T. Elliott, G. Kania, et al., B- MYB is essential for normal cell cycle progression and chromosomal stability of embryonic stem cells, PloS one, 6 (2008), e2478. doi: 10.1371/journal.pone.0002478
5. M. Joaquin, R. J. Watson, Cell cycle regulation by the B-Myb transcription factor, Cell. Mol. Life Sci., 11 (2003), 2389-2401. doi: 10.1007/s00018-003-3037-4. doi: 10.1007/s00018-003-3037-4
6. S. Sadasivam, S. Duan, J. A. DeCaprio, The MuvB complex sequentially recruits B-Myb and FoxM1 to promote mitotic gene expression, Genes Dev., 5 (2012), 474−489. doi: 10.110r1/gad.181933.111
7. R. Bayley, C. Ward, P. Garcia, MYBL2 amplification in breast cancer: Molecular mechanisms and therapeutic potential, Biochim. Biophys. Acta Rev. Cancer, 2020 (2020), 188407. doi: 10.1016/j.bbcan.2020.188407. doi: 10.1016/j.bbcan.2020.188407
8. F. Ren, L. Wang, X. Shen, X. Xiao, Z. Liu, P. Wei, et al., MYBL2 is an independent prognostic marker that has tumor-promoting functions in colorectal cancer, Am. J. Cancer Res., 4 (2015), 1542.
9. M. Zhang, H. Li, D. Zou, J. Gao, Ruguo key genes and tumor driving factors identification of bladder cancer based on the RNA-seq profile, Onco Targets Ther., 9 (2016), 2717. doi: 10.2147/ott.s92529
10. Z. Guan, W. Cheng, D. Huang, A. Wei, High MYBL2 expression and transcription regulatory activity is associated with poor overall survival in patients with hepatocellular carcinoma, Curr. Res. Transl. Med., 1 (2018), 27−32. doi: 10.1016/j.retram.2017.11.002
11. G. Raschellà, V. Cesi, R. Amendola, A. Negroni, B. Tanno, P. Altavista, et al., Expression of B-myb in neuroblastoma tumors is a poor prognostic factor independent from MYCN amplification, Cancer Res., 14 (1999), 3365−3368.
12. O. Fuster, M. Llop, S. Dolz, P. Garcíab, E. Suchc, M. Ibáñez, et al., Adverse prognostic value of MYBL2 overexpression and association with microRNA-30 family in acute myeloid leukemia patients, Leuk. Res., 12 (2013), 1690−1696. doi: 10.1016/j.leukres.2013.09.015
13. Lindgren D, Frigyesi A, Gudjonsson S, et al. Combined gene expression and genomic profiling define two intrinsic molecular subtypes of urothelial carcinoma and gene signatures for molecular grading and outcome. Cancer Res. 2010;70(9):3463-3472. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-09-4213
14. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive molecular characterization of urothelial bladder carcinoma. Nature. 2014;507(7492):315-322. https://doi.org/10.1038/nature12965
15. Song J, Abraham SN. TLR-mediated immune responses in the urinary tract. Curr Opin Microbiol. 2008;11(1):66-73.
16. Abraham SN, Miao Y. The nature of immune responses to urinary tract infections. Nat Rev Immunol. 2015;15(10):655-663.
17. Smith SG, Zaharoff DA. Future directions in bladder cancer immunotherapy: towards adaptive immunity. Immunotherapy. 2016;8(3):351-365
18. Солодкий В.А., Станоевич У., Боженко В.К., Захаренко М.В., и др. Скрининг колоректального рака: прошлое, настоящее, будущее., 2020 г.
